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　　目前皮膚致敏性試驗(yàn)方法有：豚鼠最大劑量法(GPMT)、封閉式貼敷法(Buehler試驗(yàn))、局部淋巴結(jié)試驗(yàn)法(LLNA)，其中豚鼠最大劑量法(GPMT)和封閉式貼敷法(Buehler試驗(yàn)）是最常用的、生物安全性評價(jià)中使用率最高的兩種方法。

 

　　豚鼠最大劑量試驗(yàn)是最敏感的方法，歐洲國家使用此方法較廣泛；封閉式貼敷試驗(yàn)適用于局部產(chǎn)品，美國常用此方法。局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA）被經(jīng)濟(jì)與合作發(fā)展組織接受作為當(dāng)前豚鼠試驗(yàn)的唯一替代方法，該法對動物保護(hù)方面也有所改善，也被認(rèn)可用于化學(xué)物致敏活性的檢測。

 

 

　　原理：過敏劑可誘導(dǎo)引起作用位點(diǎn)的引流淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖，其增殖程度與過敏劑的劑量和致敏效力成正比。從而提供了一種簡單的獲取定量測量致敏性的方法。BrdU是胸腺咤啶核苷的類似物并可摻入增殖細(xì)胞的DNA中。

 

　　通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法測量試驗(yàn)動物耳部引流淋巴結(jié)內(nèi)摻入BrdU的量來指示增殖細(xì)胞的數(shù)量增加，并用試驗(yàn)組與對照組的平均增殖量之比(SI)來評價(jià)增殖情況，確定待測物質(zhì)的致敏潛能。

 

　　動物管理：成年未生育過且未受孕的雌性小鼠，8周齡~12周齡，動物體重不超過平均體重的±20%。

 

　　試驗(yàn)樣品：應(yīng)為液體、懸浮液、凝膠或膏狀物，此類樣品可應(yīng)用小鼠的耳部。

 

　　試驗(yàn)設(shè)置：設(shè)置一個(gè)或多個(gè)對照組、一個(gè)陰性對照組和一個(gè)陽性對照組；每組至少使用4只動物。經(jīng)常進(jìn)行LLNA時(shí)不必每次試驗(yàn)都包括陽性對照，但至少每6個(gè)月應(yīng)采用一次陽性對照。

 

　　試驗(yàn)步驟：LLNA檢驗(yàn)化學(xué)物一般采用劑量反應(yīng)方式，醫(yī)療器械供試樣品可能為浸提液，此時(shí)僅有單劑量用于試驗(yàn)，一般可檢驗(yàn)未稀釋的浸提液。當(dāng)浸提液含有高毒性成分時(shí)，毒性在LLNA中可導(dǎo)致陰性反應(yīng)。因此在LLNA中檢驗(yàn)高毒性浸提液時(shí)，推薦采用劑量反應(yīng)方式和稀釋浸提液。

 

　　在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)應(yīng)記錄每只動物體重，將適宜的樣品應(yīng)用于指定小鼠雙耳的背側(cè)，劑量為25uL/d，連續(xù)3天。為了檢驗(yàn)試驗(yàn)樣品的潛在毒性，試驗(yàn)中應(yīng)每天觀察雙耳可能會干擾結(jié)果解釋的刺激跡象并記錄觀察結(jié)果，通過測定每只動物或匯集的淋巴結(jié)樣品來確定淋巴結(jié)反應(yīng)。

 

　　結(jié)果與評價(jià)：測定每只小鼠每分鐘淋巴結(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)(cpm)的放射活性水平。試驗(yàn)cpm除以空白cpm得出刺激指數(shù)(SI)，試驗(yàn)樣品SI≥3.0，考慮陽性，為致敏物。陽性對照樣品SI應(yīng)≥3.0。

 

 

　　原理：單一化學(xué)物采用豚鼠最大劑量試驗(yàn)，對材料在試驗(yàn)條件下使豚鼠產(chǎn)生皮膚致敏反應(yīng)的潛能做出評定。

 

　　動物與管理：使用健康、初成年的豚鼠，試驗(yàn)開始時(shí)體重應(yīng)為300g~500g，雌雄不限，雌鼠應(yīng)未產(chǎn)并無孕。

 

　　試驗(yàn)材料若為粉末或液體，至少使用10只動物接觸試驗(yàn)樣品，至少使用5只動物作為對照組。

 

　　對于浸提液試驗(yàn)，至少使用10只動物接觸試驗(yàn)樣品，至少使用5只動物作為溶劑對照組。

 

 

　　皮內(nèi)誘導(dǎo)階段

 

　　1——頭端；

 

　　2——0.1mL皮內(nèi)注射點(diǎn)；

 

　　3——去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位；

 

　　4——尾端。

 

　　按上圖在每只動物去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位成對皮內(nèi)注射0.1mL。

 

　　A部位：注射FCA與選定的溶劑以50：50體積比混合的穩(wěn)定性乳化劑，對于水溶性材料，溶劑選用生理鹽水。

 

　　B部位：注射試驗(yàn)樣品即未經(jīng)稀釋的浸提液；對照組動物僅注射相應(yīng)溶劑。

 

　　C部位：試驗(yàn)樣品以50：50的體積比例與弗氏完全佐劑和溶劑(50%）配置成的乳化劑混合后進(jìn)行皮內(nèi)注射；對照組注射空白液與佐劑配成的乳化劑。

 

　　局部誘導(dǎo)階段：皮內(nèi)誘導(dǎo)階段后6~8天，按部位B中選定的濃度，采用面積約8cm2的濾紙或吸水性紗布塊局部貼敷于每只動物的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位，覆蓋誘導(dǎo)注射點(diǎn)。如按皮內(nèi)誘導(dǎo)階段的最大濃度未產(chǎn)生刺激反應(yīng)，應(yīng)在局部敷貼應(yīng)用前22~26h，試驗(yàn)區(qū)用10%十二烷基硫酸鈉進(jìn)行預(yù)處理，按摩導(dǎo)入皮膚。用封閉式包扎帶固定敷貼片，并于46~58h后除去包扎帶和敷貼片。對照組動物使用空白液同法操作。

 

　　激發(fā)階段：局部誘導(dǎo)階段后13~15d后，用試驗(yàn)樣品激發(fā)全部試驗(yàn)動物和對照動物。按C部位選定的濃度將適宜的敷貼片置于試驗(yàn)樣品或介質(zhì)對照中浸透，局部敷貼于誘導(dǎo)階段未試驗(yàn)部位。該濃度的稀釋液可同法敷貼于其他未試驗(yàn)部位。用封閉式包扎帶固定，并于22~26h后除去包扎帶和敷貼片。

 

 

　　除去敷貼片后(24士2)h和(48±2)h觀察試驗(yàn)組和對照組動物激發(fā)部位皮膚情況，在自然光或全光譜光線下觀察皮膚反應(yīng)。按Magnusson和Kligman分級標(biāo)準(zhǔn)，對照動物分級小于1，試驗(yàn)組中分級大于或等于1時(shí)，一般提示致敏。如對照動物分級大于或等于1時(shí)，試驗(yàn)超過組動物反應(yīng)對照組中最嚴(yán)重的反應(yīng)則認(rèn)為致敏。

 

　　如疑似反應(yīng)，進(jìn)行再激發(fā)以確認(rèn)首次激發(fā)結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果顯示為試驗(yàn)和對照動物中的陽性激發(fā)結(jié)果的發(fā)生率。如試驗(yàn)組動物出現(xiàn)反應(yīng)的動物數(shù)多于對照組動物，但反應(yīng)強(qiáng)度并不超過對照組，可能需要在首次激發(fā)后1周~2周進(jìn)行再次激發(fā)，以明確反應(yīng)。所用方法與首次激發(fā)相同，采用動物未試驗(yàn)的一側(cè)部位。

 

 

　　試驗(yàn)樣品：按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行樣品制備，在不影響結(jié)果解釋的情況下，試驗(yàn)樣品濃度應(yīng)盡可能的高，試驗(yàn)樣品的性狀和尺寸適宜，局部應(yīng)用器械可原樣敷貼。

 

　　動物管理：使用健康、初成年的豚鼠，試驗(yàn)開始時(shí)體重應(yīng)為300g~500g，雌雄不限，如雌鼠應(yīng)未產(chǎn)并無孕。

 

　　試驗(yàn)材料若為粉末或液體，至少使用10只動物接觸試驗(yàn)樣品，至少使用5只動物作為對照組。對于浸提液試驗(yàn)，至少使用10只動物接觸試驗(yàn)樣品，至少使用5只動物作為溶劑對照組。

 

 

　　誘導(dǎo)階段：按選定的試驗(yàn)樣品濃度，將合適的敷貼片浸透試驗(yàn)樣品，局部敷貼于每只動物的左上背部位。(6±0.5)h后除去任何封閉式包扎帶類的固定物和敷貼片。1周中連續(xù)3d重復(fù)該步驟，同法操作3周，對照組動物僅使用空白液同法操作。

 

　　激發(fā)階段：最后一次誘導(dǎo)敷貼后(14±1)d用試驗(yàn)樣品對全部試驗(yàn)動物和對照動物進(jìn)行激發(fā)，按選定的試驗(yàn)樣品濃度將合適的敷貼片浸透試驗(yàn)樣品單獨(dú)局部貼敷于每只動物去毛的未試部位。(6±0.5)h后除去固定物、封閉包扎帶和敷貼片。

 

 

　　首次激發(fā)或再次激發(fā)接觸后(24±2)h，用市售脫毛劑給動物脫毛，將脫毛劑涂到試驗(yàn)和周圍部位；或剃去激發(fā)部位及周圍部位的動物被毛。

 

　　用溫水徹底清洗脫毛區(qū)，并用毛巾擦干動物后放回籠中。脫毛后至少2h，對試驗(yàn)部位評分，并在除去激發(fā)貼片后(48±2)h再進(jìn)行評分。

 

　　按Magnusson和Kligman分級標(biāo)準(zhǔn)，對照動物分級小于1，而試驗(yàn)組中分級大于或等于1時(shí)，一般提示致敏。如對照動物分級大于或等于1時(shí)，試驗(yàn)超過組動物反應(yīng)對照組中最嚴(yán)重的反應(yīng)則認(rèn)為致敏。如為疑似反應(yīng)，進(jìn)行再激發(fā)以確認(rèn)首次激發(fā)結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果顯示為試驗(yàn)和對照動物中的陽性激發(fā)結(jié)果的發(fā)生率。如試驗(yàn)組動物出現(xiàn)反應(yīng)的動物數(shù)多于對照組動物，但反應(yīng)強(qiáng)度并不超過對照組，可能需要在首次激發(fā)后1周~2周進(jìn)行再次激發(fā)，以明確反應(yīng)。所用方法與首次激發(fā)相同，采用動物未試驗(yàn)的—側(cè)部位。

 

　　以上大致介紹了三種皮膚致敏試驗(yàn)方法，豚鼠最大劑量法和封閉式貼敷法應(yīng)用廣泛；局部淋巴結(jié)試驗(yàn)不包括激發(fā)階段，試驗(yàn)所關(guān)注的終點(diǎn)是刺激指數(shù)(SI)，該試驗(yàn)周期較短，結(jié)果客觀敏感，所用試驗(yàn)材料較少，并且免除了弗氏完全佐劑注射。

 

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